全球有超過(guò)50,000種人類相關(guān)的遺傳疾病，其中大部分是由基因組的點(diǎn)突變（point mutation, PM）引起的。而對(duì)于罕見病而言，80%是由基因缺陷引起的，同時(shí)這些基因缺陷中點(diǎn)突變又占了60%。研究表明，點(diǎn)突變能使人類對(duì)癌癥、聽力疾病、精神病等多種疾病的易感性增加。

研究點(diǎn)突變相關(guān)遺傳疾病，免不了要構(gòu)建細(xì)胞模型。點(diǎn)突變細(xì)胞模型可以直接研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝和分化等機(jī)制，是研究基因功能和調(diào)控、癌癥、遺傳疾病等生物學(xué)和醫(yī)學(xué)問(wèn)題的重要工具，具有精確模擬基因變異、可控性高、安全省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。


點(diǎn)突變細(xì)胞模型的構(gòu)建

構(gòu)建細(xì)胞點(diǎn)突變細(xì)胞模型時(shí)的理論基礎(chǔ)是基因的同源重組修復(fù)。當(dāng)細(xì)胞基因組DNA雙鏈由于外部因素而斷裂時(shí)，細(xì)胞中存在著的DNA修復(fù)機(jī)制就會(huì)被激發(fā)，對(duì)斷裂位點(diǎn)的DNA雙鏈進(jìn)行修復(fù)，根據(jù)修復(fù)方式的不同可分為同源重組修復(fù)和非同源重組修復(fù)。顧名思義，同源重組是指DNA在修復(fù)的過(guò)程中以同源的DNA序列作為模板完美修復(fù)，而非同源重組修復(fù)是指細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)蛋白直接將斷裂的DNA兩端重新連起來(lái)，同時(shí)可能會(huì)隨機(jī)引入新的堿基。


我做得頭皮發(fā)麻的點(diǎn)突變細(xì)胞，別人卻輕松拿到純合子，怎么做到？ 第1張

DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑。（A. 同源重組修復(fù)，B. 非同源重組修復(fù)）


根據(jù)這個(gè)理論基礎(chǔ)，點(diǎn)突變細(xì)胞模型的構(gòu)建分為三個(gè)部分：

1.定點(diǎn)切割DNA

由于在自然界中DNA的斷裂是隨機(jī)的、不確定的，因此我們需要人為定點(diǎn)對(duì)DNA產(chǎn)生切割。在這個(gè)過(guò)程中，CRISPR-Cas9技術(shù)給我們提供了極大的便利。我們可以通過(guò)人為設(shè)計(jì)sgRNA，并將Cas9蛋白與sgRNA一起轉(zhuǎn)染到目的細(xì)胞中。在sgRNA的引導(dǎo)下，Cas9蛋白對(duì)靶位點(diǎn)處的DNA進(jìn)行切割，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂。


2.同源重組修復(fù)DNA

我們通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)使細(xì)胞內(nèi)的基因組DNA產(chǎn)生了雙鏈斷裂后，同時(shí)引發(fā)了細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制。因此，為了使DNA在修復(fù)過(guò)程中能通過(guò)同源重組的方式修復(fù)DNA并引入突變位點(diǎn)，我們需要為細(xì)胞提供額外的同源修復(fù)模板。這個(gè)模板的本質(zhì)是人為合成的DNA序列，由5’端同源臂、突變位點(diǎn)和3’端同源臂組成。值得注意的是，這種同源模板序列是隨sgRNA和Cas9蛋白一起轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的。


3.陽(yáng)性細(xì)胞篩選

這部分是細(xì)胞模型構(gòu)建的關(guān)鍵部分。試想下，我們通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將CRISPR-Cas9系統(tǒng)和模板DNA序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞中后，由于細(xì)胞內(nèi)部機(jī)制的作用，我們得到的細(xì)胞池中既包含純合子陽(yáng)性細(xì)胞和雜合子細(xì)胞，又包含沒有發(fā)生堿基突變的野生型細(xì)胞。那么，我們?cè)撊绾翁暨x出目的細(xì)胞呢？對(duì)于點(diǎn)突變模型來(lái)說(shuō)，由于沒有引入抗性基因，常用的方法便是通過(guò)稀釋法將細(xì)胞池的細(xì)胞稀釋轉(zhuǎn)移到96孔板中，形成單克隆細(xì)胞，然后收集單克隆細(xì)胞進(jìn)行大量測(cè)序，以得到預(yù)期的純合子細(xì)胞。

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